a.色譜柱的連接

需要的工具:3/8英寸扳手和5/16英寸扳手各一個(gè)

  請(qǐng)避免在硬物上敲擊色譜柱或?qū)⑸V柱從高處掉落，這樣可能會(huì)造成柱床斷裂，影響柱性能。

  使用外徑 1/16英寸的不銹鋼管連接色譜柱，只有不銹鋼管與色譜柱接頭的末端完全吻合，沒有死體積或漏液的情況，才能獲得最好的分離效果。當(dāng)需要擰緊或擰松色譜柱連接時(shí)，請(qǐng)將5/16英寸的扳手置于不銹鋼管的螺絲位置，將3/8英寸的扳手置于色譜柱端口的六面體位置。

  沃特世公司的色譜柱具有Parker和Waters兩種不同型式的接頭，因此與之連接的管路的錐箍也有兩種型式。如圖1所示:Waters型式的接頭要求露出錐箍的不銹鋼管路長(zhǎng)度為0.130英寸，而Parker型式的接頭則要求露出錐箍的不銹鋼管路長(zhǎng)度為0.090英寸。

  只有在管路與色譜柱正確連接的系統(tǒng)中，管路與色譜柱接口末端完全吻合，沒有死體積，才能獲得最好的分離效果。

  Parker接頭與Waters型式色譜柱連接會(huì)產(chǎn)生死體積，而流路中死體積的存在必然降低色譜柱的柱效。解決這種問題的辦法是:切掉原來的錐箍接頭，用一個(gè)新的錐箍連接到管路上做成一個(gè)新的接頭。請(qǐng)注意:在擰緊螺絲前，要保證露出錐箍的不銹鋼管路長(zhǎng)度和新的色譜柱接口匹配。

  Waters接頭與Parker型式色譜柱連接時(shí)，在錐箍與色譜柱接口完全吻合之前，不銹鋼管路就已經(jīng)頂?shù)搅松V柱接口的末端。這樣，錐箍與色譜柱接口之間會(huì)留下縫隙而產(chǎn)生漏液。解決這類問題的方法有兩種:

1)用力擰緊不銹鋼管路上的螺絲時(shí)錐箍前移與柱接口完全吻合。請(qǐng)注意:用力不可過大以免損壞柱接口或?qū)⒉讳P鋼管擰斷。

2)切掉原先的錐箍接頭，將一個(gè)新的錐箍連接到管路上做一個(gè)新的接頭。

  用沃特世公司一件式或兩件式PEEK接頭(PSL613315一件式或PSL613322和PSL613316的兩件式接頭)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的不銹鋼壓緊螺絲可以解決上述兩類問題，因?yàn)镻EEK接頭允許自由調(diào)節(jié)露出錐箍之外的不銹鋼管路長(zhǎng)度，而且可以手動(dòng)擰緊，簡(jiǎn)單方便。更方便的選擇是使用SLIPFREE連接器，它具有如下特點(diǎn):

●可將管路推入接口，保證無死體積連接

●手緊后即可耐受10,000 psi壓力

●拆開連接后可以重新適應(yīng)新的色譜柱接口，與所有商品化的接口兼容

●不銹鋼合金表面穩(wěn)定性好，且沒有顆粒物質(zhì)產(chǎn)生

●獨(dú)特的設(shè)計(jì)將固定作用與密封作用分開

b.測(cè)量系統(tǒng)的譜帶擴(kuò)展體積以及系統(tǒng)偏差

  圖6說明了管路內(nèi)徑對(duì)系統(tǒng)譜帶擴(kuò)展和峰形的影響，可以看出，大內(nèi)徑的連接管路會(huì)產(chǎn)生更大的譜帶擴(kuò)展，靈敏度更低。

以下將介紹如何測(cè)量系統(tǒng)的譜帶擴(kuò)展體積和系統(tǒng)偏差。

  注意:測(cè)試需要在配置單波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行(不要用二極管矩陣檢測(cè)器)

a)取下色譜柱，換上一個(gè)零死體積的兩通

b)將泵流速設(shè)為1ml/min

c)用流動(dòng)相將測(cè)試混合物稀釋，使檢測(cè)器靈敏度達(dá)0.5~1AUFS(可使用包含尿嘧啶、對(duì)羥基苯甲酸乙酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯的混合物，沃特世訂貨號(hào)WAT034544)

d)進(jìn)樣2~5μL

e)測(cè)量4.4%峰高處的峰寬(5-sigma方法):

5-sigma 譜帶擴(kuò)展體積(μL)=峰寬(min)×流速(ml/min)×(1000μL/1ml)

系統(tǒng)偏差(μL²)= (5-sigma展寬²)/25

典型的HPLC系統(tǒng)譜帶擴(kuò)展體積應(yīng)該在70μL至130μL之間(或偏差400μL²±36μL²)，對(duì)于使用微徑柱(如2.1mmI.D.的色譜柱)的系統(tǒng)，譜帶擴(kuò)展體積不得超過20~40μL(或偏差不得超過16μL²~64μL²)。

c.測(cè)量梯度延遲體積(或滯后體積)

  為了成功地進(jìn)行梯度方法的轉(zhuǎn)移，需要在兩臺(tái)儀器上用相同的方法測(cè)試梯度滯后體積。如下列出了測(cè)量梯度滯后體積的方法:

a)取下色譜柱，換上一個(gè)零死體積的兩通

b)準(zhǔn)備流動(dòng)相A(純?nèi)軇?，如甲?和流動(dòng)相B(流動(dòng)相A中加入有UV吸收的樣品，如含0.1%(v/v)丙酮的甲醇溶液)

c)用流動(dòng)相A平衡系統(tǒng)直到基線平穩(wěn)

d)設(shè)定檢測(cè)器波長(zhǎng)，以待測(cè)物的最大吸收為準(zhǔn)(丙酮采用265nm)

e)流速設(shè)為2mL/min，編輯一個(gè)10分鐘內(nèi)0~100%B的線性梯度(具體的條件可以適當(dāng)調(diào)整，但需要保證梯度體積不低于20mL)，然后保持100%B，采集數(shù)據(jù)f)首先測(cè)量50%吸光度處對(duì)應(yīng)的梯度中點(diǎn)時(shí)間t1/2(在起始和最終等度區(qū)間的基線之間的垂直距離的一半處,如圖8所示)

g)將梯度中點(diǎn)時(shí)間t1減去梯度時(shí)間t。的一半(本例為5分鐘)即可得到梯度滯后時(shí)間t。

h)將梯度滯后時(shí)間t_D乘以流速(2ml/min)即可得到滯后體積V_D

  提示:對(duì)快速梯度方法來講，梯度滯后體積不得超過1mL，如果超過1mL，請(qǐng)參考系統(tǒng)優(yōu)化建議部分的內(nèi)容來減小系統(tǒng)體積。